Klávesové zkratky na tomto webu - základní­
Přeskočit hlavičku portálu

Metoda MLPA detekuje specifické sekvence DNA

Komerční sdělení   7:00aktualizováno  7:00
Variabilita v počtu kopií (Copy Number Variace - CNV) je významným zdrojem genetické variability v lidské DNA a hraje roli u řady onemocnění. MLPA je semi-kvantitativní metoda, která se používá pro stanovení relativního počtu kopií až 60 sekvencí DNA v jediné multiplexní PCR reakci.

Komerční sdělení

Toto jsou komerční sdělení. iDNES.cz neovlivňuje jejich obsah a není jejich autorem. Více

Komerční sdělení je speciální inzertní formát. Umožňuje inzerentům oslovit čtenáře na ploše větší, než je klasický banner, hodí se tedy například ve chvíli, kdy je potřeba popsat vlastnosti nového produktu, představit společnost nebo ukázat více fotografií.

Aby bylo na první pohled odlišitelné od redakčních textů, obsahuje jasné označení „Komerční sdělení“ v záhlaví článku.

Pro komerční sdělení platí podobná pravidla jako pro další formy inzerce na iDNES.cz. Nesmí tedy být v rozporu s dobrými mravy a zásadami poctivého obchodního styku, nesmí porušovat práva třetích osob a poškozovat něčí dobrou pověst. Na rozdíl od bannerové reklamy je z komerčních sdělení vyloučena politická inzerce.

Komerční sdělení, jejich titulky a tvrzení v nich obsažená nesmějí být lživá a klamavá.

Ceník komerčních sdělení včetně kontaktů na obchodní oddělení najdete zde.

(Ilustrační snímek)

(Ilustrační snímek) | foto: Jiří Benák, iDNES.cz

Reagencie a širokou škálu MLPA kitů pro MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) vyrábí a prodává firma MRC-Holland. Společně tyto produkty mohou být použity k detekci delecí a duplikací ve vzorcích DNA.

Princip MLPA metody

Princip MLPA testu (obrázek 1) je založen na amplifikaci (za použití jednoho páru primerů PCR) až 60 sond, z nichž každá detekuje specifickou DNA sekvenci o délce přibližně 60 nukleotidů. Po denaturaci DNA se přidá ke vzorku směs MLPA sond. Každá MLPA sonda se skládá ze dvou oligonukleotidů, které hybridizují k přilehlým cílovým sekvencím, aby mohly být spojeny do jedné sondy. Každá sonda v MLPA kitu má jedinečnou délku amplikonu, obvykle v rozmezí od 130 do 500 nukleotidů.

V průběhu následné PCR reakce jsou všechny ligované sondy amplifikovány současně pomocí stejného PCR páru primerů. Jeden PCR primer je fluorescenčně značený a umožňuje tak vizualizaci amplifikačních produktů během separace fragmentů. Separace se provádí na přístroji kapilární elektroforézy, čímž se získá specifický elektroforeogramu (obrázek 2, vlevo).

Relativní výška každého píku jednotlivých sond ve srovnání s relativní výškou píků sond v různých referenčních vzorcích DNA odráží relativní počet kopií odpovídající cílové sekvence ve vzorku. Delece jedné nebo více cílových sekvencí vede k relativnímu snížení výšky píku (obrázek 2, vpravo), zatímco zvýšení relativní výšky píku odráží duplikaci.

Princip MLPA metody

Princip MLPA metody

A: Elektroforeogram testovaného vzorku (dole) je porovnán s profilem referenčního vzorku (nahoře) a ukazuje relativní pokles tří sond u testovaného vzorku.                 B: Vypočtené poměry sond stejného testovaného vzorku po analýze: uspořádání sond podle chromozomální lokalizace ukazuje snížený počet kopií tří sousedních sond v testovaném vzorku.

A: Elektroforeogram testovaného vzorku (dole) je porovnán s profilem referenčního vzorku (nahoře) a ukazuje relativní pokles tří sond u testovaného vzorku. B: Vypočtené poměry sond stejného testovaného vzorku po analýze: uspořádání sond podle chromozomální lokalizace ukazuje snížený počet kopií tří sousedních sond v testovaném vzorku.

Analýza MLPA výsledků

Pro analýzu MLPA dat se používá software Coffalyser.Net, který je volně ke stažení. Vybírá nejvhodnější metodu analýzy pro každý MLPA kit a nabízí rozsáhlou kontrolu kvality. Téměř všechny SALSA MLPA kity obsahují devět referenčních fragmentů.

Fragmenty pro interní kontrolu kvality.  1 Jsou známy vzácné případy, kdy muži nemají Y specifickou sekvenci a ženy mají tuto Y sekvenci na X chromozómu.

Fragmenty pro interní kontrolu kvality. 1 Jsou známy vzácné případy, kdy muži nemají Y specifickou sekvenci a ženy mají tuto Y sekvenci na X chromozómu.

Absolutní fluorescenci měřenou pomocí kapilární elektroforézy nelze použít přímo pro výpočet počtu kopií, neboť je ovlivněna mnoha proměnnými. Pro smysluplné výsledky musí být fluorescence každé sondy normalizována v každém vzorku a je třeba provést porovnání různých vzorků, abyste zjistili, který z nich má abnormální počet kopií. Proto se MLPA normalizace skládá z 2 kroků: intra-vzorková normalizace (porovnání píků sond v rámci vzorku) a mezi-vzorková normalizace (porovnání relativních píků sond mezi vzorky).

Normalizace v rámci vzorku

V každém vzorku se porovnávají píky jednotlivých sond s píky referenčních sond. Referenční sondy detekují sekvence, u kterých se očekává, že mají normální počet kopií ve všech vzorcích. Téměř všechny kity MLPA obsahují 8 nebo více referenčních sond umístěných na různých chromozómech.

Normalizace mezi vzorky

Finální poměry sond jsou určeny porovnáním relativních píků sond v testovaném vzorku DNA s píky sond všech referenčních vzorků. Předpokládá se, že referenční vzorky budou mít normální počet kopií pro referenční i cílové sondy.

Profil píků testovaného vzorku DNA bez genomových abnormalit bude totožný s profilem referenčních vzorků: finální poměry sond stanovené v kroku 2 budou ~ 1,0. U heterozygotní delece ~ 0,5. Tyto finální poměry sond se také nazývají Kvocient dávky (Dosage Quotient - DQ).

Coffalyser.Net vypočítá DQ pro každou sondu v každém vzorku. Sondy jsou uspořádány podle chromozomální lokalizace pro správnou interpretaci, a to také pomáhá při odhalování drobných změn. Tabulka uvádí vztahy mezi počtem kopií a typickou distribucí DQ.

Vztah mezi kvocientem dávky a počtem kopií (na základě normálního stavu - 2 kopie)

Vztah mezi kvocientem dávky a počtem kopií (na základě normálního stavu - 2 kopie)

Interpretace MLPA výsledků

Informace uvedené v popisu produktu pro specifický MLPA kit jsou zásadní pro správnou interpretaci výsledků. Posouzení spolehlivosti výsledků vyžaduje dobrou znalost MLPA metody a testované aplikace. MLPA metoda má určité limitace. U většiny aplikací jsou hlavní příčinou genetických defektů bodové mutace, z nichž většina nebude detekována. MLPA nebude detekovat většinu inverzí, translokací, ani změny v počtu kopií, které leží mimo cílovou sekvenci.

Změny v počtu kopií detekované jedinou sondou vždy vyžadují potvrzení jinou metodou. Pro potvrzení delece celého exonu jsou často používány metody „long-range“ PCR a qPCR. Ne všechny delece a duplikace zjištěné MLPA jsou patogenní. U některých genů delece ve čtecím rámci vede k mírnému nebo žádnému onemocnění. Duplikace jednoho nebo více exonů může však porušit kopii tohoto genu, což vede k onemocnění. V některých případech může být pro správnou interpretaci výsledků nezbytná analýza rodičovských vzorků.

Kity pro MLPA metodu

Firma MRC - Holland, jejímž českým zástupcem je firma Biogen, nabízí stovky kitů pro skríning kongenitálních a dědičných chorob či syndromů pro analýzu metylace a profilování nádorů. Kity jsou rozděleny do kategorií:

Prenatální a postnatální

Kity pro hledání příčin nesyndromové mentální retardace u novorozenců. Některé kity obsahují sondy pro všechny subtelomerické oblasti (kit P036 / P070) a centromery (kit P181 / P182). V některých případech poukazují fenotypové znaky na zapojení určitého genu nebo chromozomální oblasti.

Neurogenetika a mentální retardace

Kategorie obsahuje kity pro skríning specifických syndromů, které se projevují mentální retardací.

Dědičné nádory

Kity pro skríning dědičných nádorů jako je karcinom prsu, Fanconiho anémie, familiární MDS-AML atd.

Charakterizace nádorů

Kity určené pro analýzu DNA odvozené z nádorů.

Farmakogenetika

Kategorie nabízí kity pro studium dědičně podmíněné variability v odpovědi organismu na léky.

Metylační analýza

Kity určené pro studium metylace u různých onemocnění jako je syndrom fragilního X či Prader Willi syndrom.

Různá genetická onemocnění

Kity pro detekci změn v počtu kopií u různých genetických onemocnění, např. mikrodelece/duplikace v oblasti 22q11 způsobující různé syndromy.

Kompletní seznam MLPA kitů je uveden na

www.mlpa.com

Autor:

Komerční sdělení

Komerční sdělení je placená služba portálu zprávy.iDNES.cz, která měsíčně osloví 650 000 uživatelů. Další informace najdete ZDE

Najdete na iDNES.cz

mobilní verze
© 1999–2016 MAFRA, a. s., a dodavatelé Profimedia, Reuters, ČTK, AP. Jakékoliv užití obsahu včetně převzetí, šíření či dalšího zpřístupňování článků a fotografií je bez souhlasu MAFRA, a. s., zakázáno. Provozovatelem serveru iDNES.cz je MAFRA, a. s., se sídlem
Karla Engliše 519/11, 150 00 Praha 5, IČ: 45313351, zapsaná v obchodním rejstříku vedeném Městským soudem v Praze, oddíl B, vložka 1328. Vydavatelství MAFRA, a. s., je součástí koncernu AGROFERT ovládaného Ing. Andrejem Babišem.